Współcześnie stosuje się dwie podstawowe metody wykrywania zakażeń HIV. Rutynowe badanie polega na wykrywaniu przeciwciał anty-HIV w surowicy pacjenta. W przypadku tej metody czułość badania, czyli prawdopodobieństwo otrzymania wyniku dodatniego u osoby chorej, tzn. wykrycia zakażenia, wynosi 100%, ale wynik dodatni otrzymuje się także dla 0,5% zdrowych osób – specyficzność wynosi 99,5%. Dlatego postawienie diagnozy zakażenia HIV wymaga potwierdzenia dodatkowym badaniem za pomocą metody PCR, wykrywającym gen odwrotnej transkryptazy wbudowany w genom gospodarza. Ta metoda jest teoretycznie bezbłędna pod warunkiem utrzymywania wysokich standardów pracy laboratoryjnej. Odpowiednie próby kontrolne służą sprawdzeniu, czy:
- polimeraza DNA nie utraciła aktywności podczas przechowywania (kontrola pozytywna),
- wszystkie odczynniki są wolne od wirusowego materiału genetycznego (kontrola negatywna).
Dla trzech pacjentów uzyskano dodatni wynik testu na obecność przeciwciał anty-HIV. Z tego powodu lekarz zlecił dodatkowe badanie z wykorzystaniem metody PCR, którego wyniki podsumowano w poniższej tabeli.
| Próba | |||
| badawcza | kontrolna pozytywna | kontrolna negatywna | |
| Pacjent 1. | – | + | – |
| Pacjent 2. | + | + | + |
| Pacjent 3. | + | + | – |
Na podstawie: GenBank sekwencja nr KR861191.1; M. Fearon, The Laboratory Diagnosis of HIV Infections, „Can J Dis Med Microbiol” 16, 2005, s. 26–30; D.S Boyle i inni, Rapid Detection of HIV-1 Proviral DNA for Early Infant Diagnosis Using Recombinase Polymerase Amplification, „mBio” 4, 2013, e00135–13; S. Koblavi-Dème i inni, Sensitivity and Specificity of Human Immunodeficiency Virus Rapid Serologic Assays and Testing Algorithms in an Antenatal Clinic in Abidjan, Ivory Coast, „J Clin Microbiol” 39, 2001, s. 1808–1812.
| Zadanie 14.1. (0–3) |
Zaprojektuj doświadczenie PCR wykrywające DNA HIV wbudowane w genom gospodarza. Dla każdej z prób – badawczej, kontrolnej pozytywnej i kontrolnej negatywnej – wybierz wszystkie właściwe składniki mieszaniny reakcyjnej. Wpisz w tabelę znak „+”, jeśli składnik należy dodać do próby, albo znak „–”, jeśli ten składnik należy pominąć.
| Próba | |||
| badawcza | kontrolna pozytywna | kontrolna negatywna | |
| DNA genomowy wyizolowany od pacjenta | |||
| DNA genomowy wyizolowany z linii komórkowej zakażonej HIV | |||
| para specyficznych starterów | |||
| bufor zapewniający optymalne pH i stężenie jonów Mg2+ | |||
| termostabilna polimeraza DNA | |||
| mieszanina deoksyrybonukleotydów | |||
| Zadanie 14.2. (0–1) |
Wybierz spośród A–D i zaznacz prawidłowe sekwencje starterów polF1 i polR1, wykorzystywanych w teście diagnostycznym HIV, przyłączających się do zaznaczonych fragmentów poniższej sekwencji genu odwrotnej transkryptazy wirusa HIV, wbudowanej w genom gospodarza.
A. polF1 5′ CCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAA 3′
polR1 5′ CTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACA 3′
B. polF1 5′ TTCTACTACTCCTTGACTTTGGGGATTGTAGGG 3′
polR1 5′ TGTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCAGAG 3′
C. polF1 5′ CCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAA 3′
polR1 5′ TGTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCAGAG 3′
D. polF1 5′ TTCTACTACTCCTTGACTTTGGGGATTGTAGGG 3′
polR1 5′ CTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACA 3′
| *Zadanie 14.3. (0–2) |
Przed zabiegiem chirurgicznym pacjentowi wykonano testy na nosicielstwo wirusa HIV wykrywające przeciwciała anty-HIV. Wynik wyszedł dodatni. Pacjent nie znajduje się w żadnej z grup ryzyka zakażenia HIV. Według oficjalnych danych częstość występowania zakażenia HIV w Polsce wynosi ok. 40 osób na 100 tys.
Oblicz prawdopodobieństwo, że pacjent jest zakażony HIV, z uwzględnieniem czułości i specyficzności testu na przeciwciała anty-HIV. Zapisz obliczenia w wyznaczonych miejscach 1.–3.
1. Oczekiwana liczba osób zakażonych HIV, u których wynik testu na przeciwciała anty-HIV będzie dodatni, wśród 100 tys. losowo przebadanych osób:
2. Oczekiwana liczba osób zdrowych (niezakażonych), u których wynik testu na przeciwciała anty-HIV będzie dodatni, wśród 100 tys. losowo przebadanych osób:
3. Prawdopodobieństwo, że pacjent z dodatnim wynikiem testu na przeciwciała anty-HIV jest zakażony HIV:
*Podpunkt wycofany przez CKE
| Zadanie 14.3. (0–2) |
Oceń, czy poniższe interpretacje przedstawionych wyników badań trojga pacjentów są prawidłowe. Zaznacz T (tak), jeśli interpretacja jest prawidłowa, albo N (nie) – jeśli jest nieprawidłowa.
| 1. | U pacjenta 1. wynik testu na przeciwciała anty-HIV był fałszywie dodatni, o czym świadczy wykluczenie zakażenia na podstawie wyników PCR. | T | N |
| 2. | Wyniki testu PCR dla pacjenta 2. są niewiarygodne ze względu na dodatni wynik w próbie kontrolnej negatywnej – należy powtórzyć badanie. | T | N |
| 3. | Dodatkowe badanie techniką PCR potwierdziło podejrzenie, że pacjent 3. jest zakażony HIV. | T | N |
| Zadanie 14.4. (0–1) |
Wyjaśnij, dlaczego testy wykrywające przeciwciała anty-HIV nie nadają się do diagnostyki zakażeń HIV u noworodków i niemowląt urodzonych przez matki zakażone HIV. W odpowiedzi uwzględnij spodziewany wynik testu oraz funkcjonowanie układu odpornościowego matki.
| Zadanie 14.5. (0–2) |
Oceń, czy poniższe osoby znajdują się w grupie zwiększonego ryzyka zakażenia HIV. Zaznacz T (tak), jeśli się w niej znajdują, albo N (nie) – jeśli w niej się nie znajdują.
| 1. | Osoby przebywające w jednym pomieszczeniu z osobami zakażonymi HIV, np. w pracy lub szkole. | T | N |
| 2. | Osoby narażone na częste ukąszenia komarów i innych owadów odżywiających się krwią. | T | N |
| 3. | Sąsiedzi osób zakażonych HIV, mieszkający w tym samym domu wielorodzinnym. | T | N |
czemu jest odpowiedź c w 14.2 ?
Pisanie nici zawsze zachodzi w kierunku 5’ do 3′. Żeby stworzyć odpowiedni starter musimy zatem z obu końców sekwencji spojrzeć na fragmenty końcowe w kierunku 3′ do 5′ (żeby móc je przepisać w odwrotnym kierunku). Tak więc, fragment polF1 przepisujemy od GGGATG (czyli CCCTAC), a polR1 zaczynamy od tyłu ACATAA (czyli TGTATT). Tylko odpowiedź C ma taki zestaw
Przepraszam, ale nie rozumiem dlaczego w przypadku polF1 dolną nic uznaliśmy za matrycową a w przypadku polR1 to ta górna została za taką uznana ?