PCR to procedura, która służy do powielenia materiału genetycznego. Do probówki dodaje się następujące odczynniki: materiał genetyczny, który ma podlegać powieleniu (matrycę), nukleotydy, polimerazę DNA oraz startery – oligonukleotydy DNA wyznaczające początek i koniec powielanego fragmentu. Reakcja przebiega w powtarzających się cyklach. Każdy cykl zaczyna się od podniesienia temperatury do ok. 95 °C, aby nici DNA się rozdzieliły, następnie obniża się temperaturę, aby startery przyłączyły się do odpowiednich miejsc w matrycy. W kolejnym etapie dochodzi do syntezy komplementarnej nici. Na tym etapie w wyniku błędów polimerazy mogą zostać wprowadzone mutacje.
Za pomocą PCR powielono ludzki gen MECP2 kodujący białko MECP2A, konieczne do prawidłowego funkcjonowania mózgu. Poniżej przedstawiono początek sekwencji nici kodującej genu MECP2 oraz początek sekwencji aminokwasowej białka MECP2A.
Sekwencja nukleotydowa: 5′ ATG GTA GCT GGG ATG TTA GGG … 3′
Sekwencja aminokwasowa: N Met Val Ala Gly Met Leu Gly … C
Podczas PCR doszło w trzeciej pozycji czwartego kodonu do dwóch niezależnych mutacji: do substytucji G → A oraz do delecji jednego nukleotydu (G), w wyniku czego w mieszaninie poreakcyjnej oprócz wiernej kopii genu MECP2 znalazły się również dwa wadliwe warianty.
Na podstawie: GenBank sekwencja nr NM_004992.4
| Zadanie 15.1. (0–1) |
Wyjaśnij, dlaczego do przeprowadzenia PCR wykorzystuje się enzym – polimerazę DNA – pochodzący z organizmu termofilnego.
| Zadanie 15.2. (0–1) |
Określ, ile razy zwiększa się liczba cząsteczek DNA w trakcie każdego cyklu PCR, jeśli wydajność reakcji jest równa 100%.
………………………………………
| Zadanie 15.3. (0–2) |
Podaj sekwencje aminokwasowe kodowane przez przedstawiony fragment nici kodującej po zajściu opisanych mutacji. Sekwencje zapisz od końca aminowego do końca karboksylowego, posługując się trójliterowymi oznaczeniami aminokwasów.
- substytucja G → A –
- delecja G –
